Вы здесь

Микроэлектродная техника

В своих лекциях по физиологии, прочитанных в 1912 г., И. П. Павлов говорил: «Физиология клетки должна иметь свою чрезвычайную методику, не похожую на ту, которой мы пользовались, оперируя с целыми органами. Вы видели, что ни бог весть какая трудность получить слюну в чистом виде от всей железы, перерезать нерв и т. д. А вы подумайте, что нужно делать, какими средствами надо располагать, чтобы войти в самую клетку и ответить на вопрос, как она работает... Понятно, ответить на эти вопросы страшно трудно. Здесь потребуется огромная острота ума, огромные гениальные ухищрения. Так что, если вы подумаете, то поймете, что дно жизни, фундамент жизни спрятан от человека еще очень далеко и что для его достижения потребуется работа длинного ряда поколений исследователей. Но, конечно, как ни далека эта цель, человеческий ум уже начинает подходить к разрешению этих вопросов. Понятно, успехи миниатюрные, но они все-таки есть».

Как видно из этого высказывания, И. П. Павлов уже очень давно четко представлял себе, что «фундамент», или «дно», жизни следует искать в клетке. Но как изучить физиологию клетки, этого микроскопического элемента живого? Павлов говорил о «миниатюрных» успехах в его время. Он имел в виду опыты некоторых исследователей с облучением отдельных клеток тончайшим лучом ультрафиолетового света и наблюдением при этом за изменением работы клетки. Конечно, это были только первые шаги клеточной физиологии.

В тридцатые годы японский исследователь Като одним из первых зарегистрировал потенциалы с одиночного нервного волокна седалищного нерва лягушки. На XV Международном конгрессе физиологов, проходившем в Москве в 1935 г., Като демонстрировал свои знаменитые опыты, основанные на ювелирной технике препаровки волокон седалищного нерва и последовательной их перерезки. Под контролем микроскопа физиологи убеждались, что в участке расщепления нерва оставалось одно-единственное волокно, сохранявшее способность проводить возбуждение и реагировать по закону «все или ничего».



Однако этот путь очень труден. Он помимо огромного терпения требует, несомненно, и искусства. Поэтому физиологи в стремлении проникнуть в клетку пошли по двум разным направлениям. С одной стороны, был найден очень удобный «макроскопический» объект исследований одиночных элементов в виде гигантского аксона кальмара, который имеет диаметр до 1 мм, т. е. действительно является вполне макроскопическим. Работая с таким гигантским волокном, Ходжкин и Хаксли в 1945 г. установили кардинальные положения современной мембранной теории биоэлектрогенеза, обнаружив реверсию потенциала при раздражении этого волокна. С другой стороны, Грэхем и Джерард в 1946 г., а затем Настук и Ходжкин в 1950 г. впервые на портняжной мышце лягушки показали, что для изучения физиологии одиночного волокна нет надобности расщеплять мышцу на одиночные волокна, а достаточно проколоть поверхность любого волокна микропипеткой (с диаметром кончика не более 1 мкм), заполненной солевым раствором, чтобы зарегистрировать скачок потенциала.

В 1950 г. Светихин, а в 1951 г. Экклс впервые ввели такие микропипетки внутрь нервных клеток. Светихин ввел в клетки чувствительных ганглиев спинного мозга лягушки, а Экклс — в мотонейроны спинного мозга кошки. При этом были впервые зарегистрированы электрические ответы клеток при различных условиях их стимуляции.

В последующие годы методика микроэлектродных исследований непрерывно совершенствовалась и одновременно накапливался чрезвычайно важный материал, относящийся к физиологии клетки, особенно к физиологии нервной клетки, нервного и мышечного волокна и физиологии синапсов.

Микроэлектродная техника позволила изучать эту физиологию, не нарушая анатомической связи клеток друг с другом, их кровоснабжения и т. п. Достижения микроэлектродной техники трудно преувеличить. Они действительно являются огромными, и дальнейшие исследования, которые сейчас проводятся уже практически во всех странах мира, дают основание считать, что эта техника принесет физиологии еще немало успехов. В Советском Союзе микроэлектродную технику впервые применил П. Г. Костюк, который в 1960 г. издал первую монографию, посвященную описанию микроэлектродной техники.

Вспомогательные приборы

Микроэлектроды применяются либо для внутриклеточного, либо внеклеточного или, наконец, фокального отведения биоэлектропотенциалов. В последних случаях они могут иметь толщину от 1 до нескольких (15—20) микрометров. В первом случае они должны иметь диаметр кончика, менее 1 мкм (до 0,1 и даже до 0,05 мкм). Микроэлектроды делаются металлическими или стеклянными. Металлические электроды изготовляются из нержавеющей стали, платины, нихрома, константана, вольфрама и т. п. С этой целью проволочки из металла подвергаются электролитическому затачиванию. При помощи специального приспособления они плавно погружаются в смесь концентрированной серной и ортофосфорной кислот. При этом электроды соединяются с анодом источника тока (6 В), а индифферентный (относительный электрод), также опущенный в электролит, соединяется с минусом источника. Регулируя погружение проволочки, а также силу пропускаемого тока, можно в широких пределах варьировать форму кончика микроэлектрода и его диаметр. После подобного «затачивания» электрода он промывается в растворе соляной кислоты, затем в дистиллированной воде и высушивается. Противоположный конец проволочки электролитическим путем покрывается медью, что облегчает припаивание к нему отводящего проводничка.

Иногда заточку ведут в молярном растворе соляной кислоты. Все же металлические электроды трудно получить диаметром менее 10—20 мкм. Наиболее тонкие металлические электроды удавалось получить из вольфрама, затачивание которого производится в насыщенном растворе KNО2 при пропускании переменного тока напряжением 2—6 В. Тонкие металлические электроды становятся очень мягкими и их использование оказывается затруднительным. Изготовленные микроэлектроды должны быть тщательно (за исключением кончика) изолированы (лучше всего заводской эмалью). Иногда для изоляции употребляют бакелитовый лак, полистирол, клей БФ. Сушат электроды вверх кончиком, при этом последний оказывается свободным от покрытия. Дефекты и трещины в покрытии обнаруживаются под микроскопом, но чаще и точнее с помощью электрического контроля. С этой целью электрод погружается в стаканчик с солевым раствором и соединяется (как и раствор) с источником тока. В цепь включен миллиамперметр. При хорошем покрытии ток возникает при соприкосновении кончика электрода с жидкостью, и при дальнейшем погружении этот ток не изменяется. Новые скачки тока указывают на дефекты покрытия. Преимущество металлических электродов состоит в их относительно небольшом сопротивлении. Все же мягкость не позволяет использовать их для внутриклеточного отведения потенциалов. В настоящее время иногда делают металлические микроэлектроды в стеклянной изоляции. В этом случае проволочка (как наполнитель) вытягивается вместе со стеклянной трубочкой, куда она вставлена. В качестве такого наполнителя применяют платину или (еще лучше) индий.

Стеклянные микроэлектроды изготовляются из тугоплавкого стекла. Лучшим стеклом для этих целей является «пирекс». Для изготовления микроэлектродов берутся трубочки-заготовки диаметром до 1,5—2 мм. Из таких трубочек-заготовок вытягивают микропипетки либо вручную (что требует очень большого навыка), либо на специальных микрокузницах (автоматы и полуавтоматы). Принцип работы таких микрокузниц состоит в том, что закрепленная вертикально (а иногда расположенная горизонтально) трубочка нагревается платиновой спиралью в одной своей части. В этом месте трубочка под влиянием активного натяжения вытягивается и разрывается. В хороших автоматах таким образом можно получить сразу два микроэлектрода.

Иногда из стеклянных заготовок изготовляют двухствольные или многоствольные микроэлектроды, склеивая заготовки и вытягивая их вместе (до пяти). Такие электроды удобны в целях одновременного раздражения клетки и отведения от нее потенциалов или отведения потенциалов и введения в клетку различных ионов и т. п.

Готовые микроэлектроды заполняются электролитом. Первые микропипетки заполнялись изотоническим раствором хлористого калия, однако сопротивление таких микроэлектродов оказывалось чрезмерно высоким (50— 150 мОм). Поэтому вскоре для заполнения стали рекомендовать более концентрированные растворы (3 или 2,5 М) хлористого калия (2,5 М раствор, по данным П. Г. Костюка, уменьшает возможность кристаллизации электролита в кончике микроэлектрода). Раствор хлористого калия берется потому, что этот раствор существенно не изменяет внутренней среды клетки, содержащей большое количество ионов калия (около 0,12 М) и не создает высокого собственного потенциала электрода. Проблема заполнений микроэлектродов является довольно сложной. Микроэлектроды укрепляются резиновым ободком на стеклянной пластинке (предметное стекло) острием вниз и кипятятся в растворе хлористого калия в течение 30 мин. Однако при этом кончики многих микроэлектродов часто обламываются. Поэтому сейчас чаще пользуются промежуточным наполнителем, применяя для этой цели метиловый спирт. Электроды помещают в метиловый спирт, который начинает кипеть уже при очень низкой температуре и быстро заполняет микроэлектрод. После 10—15 мин кипячения электроды оставляют на такое же время при атмосферном давлении. При этом пузырьки воздуха быстро исчезают. Штатив с электродами затем споласкивается дистиллированной водой и переносится в раствор хлористого калия, в котором оставляется до следующего дня. За это время происходит полное замещение метилового спирта электролитом. Описаны и другие способы заполнения микроэлектрода.

Сопротивление микроэлектродов, изготовленных из стекла с диаметром кончика около 0,5 мкм, колеблется в пределах 10—30 мОм.

Микроэлектроды имеют свой собственный потенциал. Этот собственный потенциал не играет существенной роли при регистрации быстрых колебаний потенциалов живых тканей. Но при регистрации мембранных (внутриклеточных) потенциалов роль собственных потенциалов электродов возрастает и они оказываются нежелательными.

Для внутриклеточной регистрации потенциалов предпочтительнее отбирать электроды, имеющие наиболее низкий собственный потенциал (не выше 5 мВ).

Присоединение стеклянных микроэлектродов к входному устройству достигается погружением в широкую часть капилляра платиновой или серебряной проволочки, соединенной с входным каскадом. Однако при точных измерениях такой способ соединения не годится. В этих случаях стеклянный микроэлектрод соединяется с входом при помощи агарового мостика, куда погружается хлорированная серебряная проволочка, связанная с входом усилителя.



Схема масляного микроманипулятора

Погружение микроэлектродов в ткань может производиться при помощи микроманипуляторов (например, MM-I). Широко применяются масляные микроманипуляторы, позволяющие осуществлять достаточно плавное погружение микроэлектродов. Схема одного из таких микроманипуляторов изображена на рис. 29. Он состоит
из трех шприцов, к поршню одного из которых крепится микроэлектрод. Второй (крупный) шприц связан с винтом грубой подачи, а третий (малый) с микрометрическим винтом для плавной подачи микроэлектрода. Все соединительные полиэтиленовые трубки заполняются вазелиновым маслом. Микроэлектроды легко могут обламываться при попытке проколоть ими твердую мозговую и даже мягкую и паутинную оболочки мозга. Поэтому эти оболочки предварительно вскрывают иголочками. В некоторых случаях оболочка самой клетки не позволяет ввести микроэлектрод (например, клетки периферического симпатического ганглия). В этих случаях электрод подается либо толчками, либо ткань подвергается вначале действию трипсина или гиалуронидазы, частично растворяющих капсулы клеток.

Большие трудности при работе с микроэлектродами создаются пульсациями мозга (дыхательными и сердечными), а также сокращениями отдельных клеток (мышечных, сердечных). Для борьбы с этими явлениями приходится заботиться о жесткой иммобилизации животных, об исключении всяких вибраций стола и станка, к которому прикреплен препарат, о создании изометрического режима для сокращающихся тканей и т. п. В этих целях применяют особо жесткие схемы фиксации животного, курареподобные препараты (тубокурарин, флакседил, листенон, прокуран, дитилин), искусственное дыхание с малой амплитудой колебаний грудной клетки, накладывание на мозговую поверхность пластинки под небольшим давлением, а также использование «плавающих» микроэлектродов, пульсирующих вместе с мозгом. Во всех этих случаях необходимо помнить о сохранении нормальных условий для жизнедеятельности клеток.

Известную трудность представляет определение расположения кончика отводящего микроэлектрода. Только в некоторых случаях микроэлектроды вводятся под контролем микроскопа (поперечно-полосатая скелетная и сердечная мышцы, нервные клетки ганглиев беспозвоночных и спинальных ганглиев позвоночных и т. п.). В большинстве же случаев микроэлектроды вводятся «вслепую» и поэтому возникает необходимость определения их локализации в последующем. В этих целях применяют разные способы. Иногда микроэлектрод покрывается тушью и потом на срезах мозга выявляется его тракт (учитывать при этом следует усадку тканей при фиксировании). Простым способом является оставление микроэлектродов в тканях и фиксирование тканей вместе с ними (способ не очень точный, так как при этом электрод может сместиться). Более точные результаты дает пропускание через микроэлектрод в течение нескольких секунд электрического тока (после окончания опытов), который вызывает электрокоагуляцию ткани вокруг кончика, а при использовании стальных электродов и отложение небольшого количества железа. Последнее обнаруживается путем витальной инъекции в артериальное русло 20%-ного раствора K4[Fe(CN6)] с соляной кислотой. Далее мозг промывают физиологическим раствором и фиксируют в формалине. Область размещения кончика микроэлектрода оказывается окрашенной в синий цвет.

Несмотря на ряд методов, предложенных для маркировки кончика микроэлектродов, до сих пор эта маркировка представляет большие трудности и не всегда дает хороший результат.

Входные каскады и усилители. Для работы с тонкими микроэлектродами обычные усилители (с обычным входом) оказываются непригодными. Это связано с большим сопротивлением микроэлектродов и относительно небольшим входным сопротивлением усилителя. Существует следующая зависимость между входным Еген от сопротивления входа Rвх и электродов Rэл:

Входные каскады и усилители

Если сопротивление электрода будет очень большим, а сопротивление входа малым, то дробь окажется очень малой (например, 1/10), т. е. регистрируемый потенциал окажется ослабленным в 10 раз. Можно идти по линии уменьшения сопротивления микроэлектрода, но это практически (при тонких электродах) невозможно. Тогда нужно увеличить сопротивление входа, сделав его во много раз большим, чем сопротивление микроэлектрода. Но в этом случае при наличии сеточного тока возникающее падение напряжения на сопротивлении в цепи сетки затруднит измерение отводимых постоянных разностей потенциалов. Кроме того, сеточный ток может оказывать значительное поляризующее влияние на клетку.

С другой стороны, высокое сопротивление микроэлектрода и высокая входная емкость обычных усилителей приводят к значительному увеличению постоянной времени усилителя (τ=RC). Например, при сопротивлении электрода 20 мОм и входной емкости 200 пикофарад τ = 4 мс. Длительность же пиковых потенциалов нервной клетки около 1 мс. Ясно, что при такой постоянной времени генерируемый потенциал будет зарегистрирован с большим искажением и уменьшением.



Принципиальные схемы усилительных каскадов

Все эти соображения заставили при работе с микро-электродами прибегать к использованию особого входного каскада, который получил название катодного повторителя. Отличие катодного повторителя от усилительного каскада состоит в том, что выходной сигнал в нем снимается не с анодной нагрузки, а с катодной (рис. 30). В обычном усилителе каскад значительно усиливает напряжение входного сигнала. Катодный же повторитель не может иметь коэффициент усиления, больший единицы, потому что в нем используется 100%-ная отрицательная обратная связь (через катодную нагрузку устанавливается постоянное смещение на сетку и величина его будет тем большей, чем больше будет катодный ток). Снимаемое с катодной нагрузки напряжение совпадает по фазе с напряжением на входе, поэтому он и называется повторителем (в обычном усилителе выходное напряжение оказывается в противофазе с входным). Преимущество катодного повторителя состоит в том, что он при высоком входном сопротивлении имеет низкое выходное сопротивление. Это позволяет согласовать выход катодного повторителя с выходом последующих усилительных каскадов и без существенных искажений передать быстрые колебания.

Конструктивно входные каскады (катодные повторители) выполняются в виде небольших отдельных блоков, которые располагаются максимально ближе к объекту отведения потенциала (для уменьшения емкости входа). Входное устройство должно включать и ряд вспомогательных приспособлений, позволяющих в любой момент быстро измерить сопротивление микроэлектрода, определить коэффициент усиления усилителя, величину сеточного тока входного каскада и т. д.

Для регистрации момента попадания электрода в клетку применяется звуковой контроль. С этой целью усилитель соединяется с динамиком (или наушником). Звуковой контроль очень хорош и для длительного наблюдения за спонтанными импульсными разрядами клеток или их констелляций. Чрезвычайно удобна запись внутриклеточных потенциалов на магнитную пленку, а также включение в цепь приборов для автоматического подсчета импульсов.

Регистрацию внутриклеточных и внеклеточных потенциалов можно проводить с помощью электронных или шлейфных осциллографов. При регистрации одиночных пробегов луча, синхронизированных с раздражениями, наиболее удобным методом является фотографирование их поперек пленки при помощи обычного фотоаппарата с насадочной линзой.

Микроэлектродная техника открыла широкие возможности для изучения физиологических процессов, протекающих в отдельных клетках, причем в условиях, максимально близких к естественным. В последние годы разработаны методы регистрации импульсной активности нейронов мозга в хронических экспериментах, что еще более повысило значение микроэлектродной техники.

С помощью вживленных в мозг человека (с лечебной целью) тонких металлических электродов удается регистрировать импульсную активность множества нейронов. Исследования Н. П. Бехтеревой (1974) выявили зависимость импульсации нейронов человека от физических характеристик и смыслового содержания воспринимаемых слов. Разумеется, эти исследования потребовали применения вычислительных машин для анализа регистрируемых потенциалов.